Memurnikan Neutrofil

Fraksi neutrophil setelah dimurnikan

Mungkin beberapa dari kita termasuk tenaga kesehatan familiar dengan sel darah putih bernama neutrofil. Sel yang jumlahnya sekitar 70% dari total sel darah putih berperan sebagai prajurit pertama dalam perang melawan ‘bandit-bandit’ yang akan menyerang tubuh. Sel ini diproduksi tubuh sekitar 100 milyar buah setiap hari  dan selalu menjadi pedoman pertama mengetahui ada tidaknya infeksi pada tubuh seseorang. Neutrofil hanya berukuran seperseribu ukuran kancing baju, tetapi mempunyai banyak ‘senjata pamungkas‘ yang sangat dibutuhkan tubuh untuk menjaga kebugarannya melawan infeksi pada tahap pertama, termasuk kemampuannya memakan kuman dan melepaskan reactive oxigen species (ROS) yang penting dalam penghancuran kuman tersebut. 

Mengetahui kadar neutrofil dalam darah seseorang akan memberikan petunjuk terhadap adanya infeksi akut yang  diderita. Hal ini disebabkan karena pada infeksi yang baru terjadi, terdapat peningkatan sel darah putih jenis ini. Oleh karena itu, neutrofil dikatakan sebagai pencetus terjadinya pertahanan tubuh alami dan akan membantu dalam pertahanan tubuh selanjutnya. Hal ini menjadikan neutrofil menjadi sel darah putih yang sangat penting.

Neutrofil yang dimurnikan dari banyak cairan tubuh seperti darah, cairan dalam rongga perut (peritoneum), cairan dalam rongga antar selaput paru-paru (pleura) dan cairan lainnya diperlukan para peneliti untuk mempelajari neutrofil, termasuk sifat, cara kerja dan zat-zat yang dihasilkannya. Di laboratorium kami, pemurnian neutrofil dilakukan dengan cara ‘density gradient’ yang menggunakan senyawa ‘percoll’. Percoll adalah suatu senyawa yang memliki tingkat pemisahan yang bagus sehingga cocok digunakan dalam memisahkan sel darah putih.  Sebelumnya percoll juga digunakan untuk memisahkan sperma dalam cairan mani.

Langkah-langkah pemurnian neutrofil secara singkat dijelaskan berikut ini;

Pada eksperimen ini saya sering menggunakan tikus coba dari jenis tikus putih (Balb/c). Saya mengambil neutrofil pada rongga periteum dari tikus tersebut. Untuk mendapatkan jumlah neutrofil yang banyak dan cukup untuk keperluan penyuntikan maupun stimulasi nantinya, 18 jam sebelum tikus tersebut ‘dipanen’, senyawa casein sebanyak 1 ml disuntikkan intra peritoneal. Tindakan ini diulangi 3 jam sebelum tikus tersebut di panen. Setelah di bius mati dengan menggunakan cairan anestesi berlebih, cairan peritoneum diambil dengan menggunakan jarum suntik 10 ml, dengan terlebih dahulu memasukkan 10 ml PBS (cairan pengganti ringer laktat yang biasa digunakan di laboratorium) dingin sebagai cairan pencuci. Setelah itu cairan peritoneum tersebut siap untuk dimurnikan. Selain cairan peritoneum, kita bisa juga menggunakan cairan pleura maupun darah untuk memurnikan neutrofil, walau kadang kadarnya tidak sebanyak yang akan kita peroleh pada cairan peritoneum yang telah distimulasi dengan casein.

Cairan pleura atau cairan lainnya yang akan diteliti harus bebas dari sel darah merah, atau minimal sedikit memiliki sel darah merah. Adanya sel darah merah yang banyak dikhawatirkan akan menurunkan kemampuan percoll untuk memisahkan beberapa jenis sel, walaupun sel darah merah itu sendiri akan berada paling bawah ketika tabung reaksi selesai di putar (sentrifus). Cara menghilangkan sel darah merah bisa dengan menambahkan buffer penghancur sel darah merah (RBC lysis buffer) selama 4 menit dan kemudian dicuci dengan menggunakan PBS, dan kemudian disentrifus. Sel tersebut kini akan tampak lebih terang (putih) dari sebelumnya yang berwarna kemerahan akibat adanya sel darah merah.

Cairan percoll terlebih dahulu diencerkan dengan tiga konsentrasi berbeda dengan menambahkan PBS, yaitu dengan konsentrasi 71,2%, 62,3% dan 53,4%. Sel yang akan dimurnikan dimasukkan ke dalam tabung reaksi (falcon) 15 ml. Kemudian dengan menggunakan jarum yang digunakan untuk melakukan anastesi spinal (jarum panjang), 3 ml cairan percoll dengan konsentrasi terendah (53,4) disuntikkan secara perlahan, sehingga sel tadi yang berada di bawah akan naik ke atas. Hal ini kemudian diteruskan dengan menyuntikkan 3 ml cairan percoll dengan konsentrasi  62,3% dan kemudian di tutup dengan menyuntikkan percoll dengan konsentrasi paling besar (71,2%). Setelah itu tabung tersebut di sentrifus selama 20 menit pada suhu 15°C dengan kecepatan 500xG. Setelah disentrifus, akan tampak adanya pemisahan beberapa jenis sel, yaitu monosit yang berada pada lapisan paling atas, kemudian PMN/neutrofil dan yang terakhir adalah sel darah merah yang berada pada dasar tabung reaksi (lihat gambar). Setelah diambil secara perlahan-lahan menggunakan jarum, sel neutrofil dicuci terlebih dahulu sebanyak dua kali untuk menghilangkan cairan percoll yang mungkin masih ada didalamnya. Setelah pencucian tersebut, sel neutrofil siap digunakan.

Jika sel netrofil ingin disuntikkan ke dalam tubuh hewan coba atau untuk distimulasi dengan berbagai jenis antigen, maka proses pemurnian netrofil di lakukan dalam kotak steril (bench) untuk menghindari kontaminasi dengan bakteri yang akan mempengaruhi hasil dari eksperiment yang akan kita lakukan. Sangat penting diperhatika bahwa semua proses tersebut diatas hendaknya sel tetap dipertahankan dingin dengan memasukkannya dalam es, kecuali jika disebutkan berlainan. Selamat mencoba.

Bahan yang dibutuhkan:

1.      Hewan coba

2.     10x PBS

3.     1x PBS

4.     Percoll

5.     Casein. 2,25 gram casein dicampurkan dengan 1 ml NaOH 1M ditambah dengan 20 ml ddH₂O, kemudian di aduk pada suhu 70°C selama 1 jam (menggunakan alat pengaduk magnetik). Setelah larut, ditambahkan 2,5 ml MgCl₂ 5 mM dan 2,25 ml CaCl₂ 10 mM. Setelah diautoklav, disimpan pada suhu 4°C.

Alat yang dibutuhkan

1.     Jarum suntik panjang (yang biasanya digunakan untuk anastesi spinal)

2.    Jarum suntik 1 ml/ 5 ml

3.    Jarum suntik 10 ml

4.    Tabung falcon 15 dan 50 ml